Page 51 - 中國動物保健雜誌2018年第20卷第4期

超?台，?自北京半?体一厂。 表1 ?新城疫病毒RT-PCR引物
1.4 引物??与合成 引物名? 引物序列 (5’-3’) 引物 /bp 退火 /℃
?考新城疫??技? GB/T NDV F 5’-ATGGGCYCCAGAYCTTCTAC-3’ 20 55
NDV R 5’-CTGCCACTGCTAGTTGTGATAATCC-3’ 25
16550-2008 中 RT-PCR 通用引
物，引物序列 ( 表 1）：
1.5 病料的?理
表2 新城疫病毒RT-PCR反?体系
?采集到的 16 份疑似新城疫 ?? 体?/μL
病料按 OIE 手?中??与疫苗? DEPC 水 13.6
10?loading Buffer 2.5
准部分?于新城疫病毒?理的?准 dNTP 2
方法?行，具体方法?：??存的 RNase Inhibitor 0.5
AMV反??? 0.7
病料融化后剪碎，放入研磨器中，
Taq? 0.7
加入?菌 PBS 研磨并加入青?霉 上游引物 1
下游引物 1
素??度? 1mg/mL，得到的?
模板RNA 3
?液加入等体?氯仿，充分震?后 ?? 25
置于 4℃ ? 夜，12,000rpm 离心
15min ?上清移入?菌的 EP 管
中?用。 1.8 ?性病料PCR?? 加入 50μL 1% ???胞，震?器
1.6 疑似病料RNA的提取及RT- ?照 RNA 常?提取方法，取 震? 1min 混?，放入 37℃恒?箱
PCR?? 1.7 中?性病毒?品 250μL，加 20min ?行反?。
分?取 1.4 ?理后的上清液 Trizol 750μL，?烈振? 15s，? 通?血凝抑制??（HI）??
100μL 于 EP 管?，加入裂解液 置 5min；加 500μL 氯仿，混?， 新城疫病毒凝集价：根据 1.9 血凝
600μL，充分?倒混?，室?? ?置 5min，4℃、12,000r/min 离 ???果，?新城疫?性尿囊液按
置 3 ～ 5min；?液体吸入吸附柱 心 15min；取上清液加等体?异丙 照血凝滴度配制成 4 ?血凝?位抗
中，13,000rpm 离心 30s；?去 醇，混?，液氮沉降 20min，取出 原； 取 96 孔板，在第 1 ～ 11 孔
收集管中液体，加入 600μL 洗 室?融化后，4℃、12,000r/min 离 加入 0.025μL PBS，第 12 孔加
液，13,000rpm 离心 30s，重复 心 20min；?上清液，加 -20 ℃ 入 0.05μL PBS；在第 1 孔加入
?步?一次；?去收集管中液体， 75% 乙醇 1mL，?置 15s，倒 0.025μL ?准?性血清混?，然
13,000rpm 空柱离心 2min；?吸 掉，重复一次；超?台?干后，加 后?第 1 孔吸出 0.025μL 液体加
附柱移入新的 1.5mL 离心管中，向 20μL DEPC 水溶解 RNA，分光 入第 2 孔，依次加至第 10 孔，第
柱中央加入洗?液 50μL，室?? 光度??? RNA 含量，-80℃保存， 11 孔??性?照，第 12 孔??
置 1min，13,000rpm 离心 30s， ?用。 性 PBS ?照；在第 1 ～ 11 孔加入
离心管中液体即?模板 RNA。 RT-PCR 反?体系（表 2）。 0.025μL 4HAU 抗原；每孔加入
RT-PCR ?体?? 20μL，加 反 ? ? 件： 反 ? ? 42 ℃ 0.025μL 1% ?血?胞?液，震?
入 16.8μL RT-PCR 反?液， 45min；??性 95℃ 3min；94℃ 混?，放 37℃恒?箱 20min 后，
1.2μL ?混合液，加提取的 RNA 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，30 ? ? PBS ?照孔??胞呈明??扣?
2μL。反??件：42 ℃ 45min， 循?；?延伸 72℃ 10min。?物? 沉到孔底?判定?果。
94℃ 3min；循? 94℃ 30s，55℃ 行?泳。 1.10 ?性??抗原??与?活
30s，72 ℃ 30s， 共 35 次； 再 1.9 病毒效价??与凝集价?? 取 SPF ?胚繁殖病毒?性尿
72℃延伸 7min。 通?血凝??（HA）??新城 囊液 50mL 加入透吸袋里，透吸袋
1.7 SPF?胚培? 疫病毒效价：取 96 孔板，每孔加 ??用?用止血??住，? 500mL
? 1.4 中?理后的?性病料上 50μL PBS；第一孔加 50μL ? 10% 的蔗糖溶液倒入搪瓷?里?
清液 100μL 超?台?菌接种于 9 性尿囊液混?，抽取第一孔 50μL ?， 放 入 ? 有 50mL 病 毒 尿 囊 液
日? SPF ?胚尿囊腔，37℃培? 混合液加入第二孔，依次??性尿 的透吸袋，根据?透?差的方向，
24h 后?死亡 SPF ?胚取出，72h 囊液?行 2 -1 ～ 2 -12 稀?，第十二 10% 的蔗糖溶液?水分? 50mL
后?菌取尿囊液，??三代。 孔混?后?去 50μL；然后在每孔 病毒尿囊液透析袋里析出，?透析

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