Page 90 - 中國動物保健雜誌第19卷第1期
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??研究
3）Biospin ?菌基因? DNA 提取??盒?自杭 ?副?嗜血杆菌后，?菌液放 2～8 ℃保存?用。
州博日生物科技有限公司，批?： 20160601； 1.6 ?品的?理
4）PCR ?增??盒?自杭州博日生物科技有 1）?菌采集疑似病例肺?病?部位。???剪
限公司， 批?： 20161001； 碎， 按 1 g 加入生理?水?行研磨，收集混?液于 2
5）DNA Marker DL2000 ?自杭州博日生物科技 mL ?菌离心管?离心 15 min，?上清。收集沉淀，用
有限公司； 1 mL 生理?水重?；
6）TAE ??液?自上海百?生物技?有限公司； 2）? 500μL 腹水和 500μL 生理?水等体?
7）?脂糖?自 BIOWEST 公司； 混?后，7 500 g 离心 20 min，?上清，收集沉淀，用 1
8）副?嗜血杆菌干粉培?基?自招?拓普生 mL 生理?水重?；
物工程有限公司； 3）??干的金?色葡萄球菌、沙?氏菌、大?
9）NAD ?自招?拓普生物工程有限公司； 杆菌按常?方法复?后，接种于??肉?，用于
10）牛血清?自四季青生物有限公司。 DNA 的提取；
1.3 ?器 4）?准菌株? 1.5.3 所配制的菌液用于 DNA
1）PCR ?增??自 TaKaRa 公司； 提取。
2）???光定量 PCR、离心机均?自 Thermo 1.7 DNA 提取
Fisher 公司； 按照 Biospin ?菌基因? DNA 提取??盒?明
3）紫外凝?成像??自美?伯?； ??行提取。
4）?泳??自北京六一?器厂。 1.8 反?体系及?件
1.4 引物 1）按照 NY/T2417-2013 中?人民共和???
按照 NY/T2417-2013 中?人民共和???行? 行??准《副?嗜血杆菌 PCR ??方法》的反?体
?准《副?嗜血杆菌 PCR ??方法》中??的引物 ： 系：10×PCR buffer 5μL，dNTPs 4μL，F1 和 F2 引物
F1：5'-TAT CGG GAG ATG AAA GAC-3'；F2：5'-GTA 各 0.5μL，Revx 引物 1μL，提取的 DNA 2μL，?菌
ATG TCT AAG GAC TAG-3'；Revx：5'-CCT CGC GGC 超?水 36.5μL，Taq DNA 聚合? 0.5μL。反??件：
TTC GTC-3' 引物由生工生物工程 （上海）股份有限 94 ℃?性 3 min；94 ℃?性 1 min，56 ℃退火 45 sec，
公 司 合 成 ， 用 高 ? ? 的 去 离 子 水 稀 ? ? ? 度 72 ℃延伸 1 min，35 ?循?；最后72 ℃延伸10 min。
20μmoL/L。 3）常? PCR ?? 盒 反?体 系：提 取 DNA
1.5 相?溶液的配制 4μL，反?液 21μL。反??件： 94 ℃ 2 min；94 ℃
1.5.1 副?嗜血杆菌培?基的制? 副?嗜血杆菌干 30sec，58 ℃ 30 sec，72 ℃ 30 sec，35 ?循?。
粉培?基 13.6 g 溶于 400 mL 超?水中，加入??? 4）?光定量 PCR 反?体系：提取 DNA 4μL，
脂 10 g，121 ℃?菌 25 min，冷?到 50 ℃左右， 加入 反?液 20μL，?液 1μL。反??件： 95 ℃ 10 min；
NAD 1 mL 和新生牛血清 20 mL，倒平皿， 待凝固后 94 ℃ 15 sec，55 ℃ 30 sec，40 ?循?。
倒置， 培? 24 h 后??菌生?后， 4 ℃保存?用。 1.9 特异性??
1.5.2 副?嗜血杆菌液体培?基制? 副?嗜血杆菌 ?副?嗜血杆菌?准菌株、金?色葡萄球菌、沙
干粉培?基 13.6 g，用超?水定容至 400 mL，高?? ?氏菌、大?杆菌的 DNA 分?按照 1.8（1、2、3）?行
菌，?用。使用前加??除菌的 NAD 和新生牛血清 ?增，并?行重复性??。
20 mL。 1.10 ?敏性??
1.5.3 副?嗜血杆菌?准菌液的制? ?副?嗜血杆 ??准菌株依次稀?成1?103、1?104、1?105、
菌?准菌株接种于 1.5.2 所述的液体培?基中?行 1?106、1?107、1?108、1?109、1?1010，分?提取
复?， 37 ℃培? 24 h 后，?菌液平?在 1.5.2 所述的 DNA，分?按照 1.8 ?行?增，并?行重复性??。
培?基，37 ℃ 24 h 后挑取??菌落?行?定，确定 1.11 ?果的判定
