Page 103 - 中國動物保健雜誌2017年第19卷第4期
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??研究


              封?孔，置于 37 ℃??孵育，不必翻蛋，每天照胚                         的平皿中；?脾?剪碎放在?网上，用注射器?芯
              2～3 次。?在 48 h 前死亡的?胚?去，48 h 后，每                   ??研磨脾?；取出?网，反复吹吸几次后，?脾?
              4～8 h 照胚 1 次，死亡的?胚??取出，直至 120                     胞?液?移到 50 mL 离心管中，加不完全培?液至

              h，不?死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于                           30 mL，混?， 1500 r/min、4 ℃离心 6 min，?上清；然
              2～8 ℃冷?。                                          后向?胞沉淀中加入 10 mL ??胞裂解液，重?，
                  ?冷? 4～24 h 的?胚取出，用碘酊消毒气室                      37 ℃裂解 5 min 后， 1500 r/min、4 ℃离心 6 min，?
              部位，然后以?菌手?去除?定部卵?，揭去卵?                            上清；?胞沉淀用 10 mL 含 3%血清的 Hank's 液洗
              膜，剪破?毛屑囊膜及羊膜，收集 48～120 h 死亡和                      ? 2 次；用 RPMI-1640 完全培?液?制?好的脾淋
              120 h 后的活胚的尿囊液，?胚?收，并分??定每                        巴?胞?液?整至 2×106 ? /mL 后，加至 96 孔?
              胚的 HA 效价及混合后原液的 EID50。                            胞培?板中，每孔 200 μL。每只?脾淋巴?胞分?
              3.1.2 新城疫?活疫苗的制? ??活并??合格的                        ? 9 孔，其中 3 孔加入 20 μL ?化的新城疫病毒作
              ?胚尿囊液混于同一容器?，先加入 5％体?的吐                           ?特异性刺激抗原作???孔，??度? 5 μg/mL；
              ? -80，充分??，至吐? -80 完全融解；再按 l?                     3 孔不加入任何刺激抗原作??胞增殖的本底?
              1.5 体?分?加入本?明?施例 1 至 3 制?的佐?                      照、 3 孔加入??度? 20 μg/mL 的刀豆球蛋白 A

              或者加入白油佐?，充分乳化后，取一洁?吸管，吸                          （ConA）作??性?照；37 ℃ 5%CO2 培?箱?培?
              取少量疫苗滴于冷水中，除第 l 滴外，不?散，判?                         60 h；加入 10 μl 的 CCK-8 ??后??培? 4 h，于
              合格。充分??后，定量分?，置 2～8 ℃?用。                          450 nm 波??量各孔的吸光度，?算刺激指?。
              4 免疫??                                                刺激指? （Stimulation Index，SI）= ??? OD 均
                  ?了排除免疫抗原量?免疫效果的影?，??                          值 / 相?本底 OD 均值。
              SPF ?胚?增的病毒液与含不同?度左旋咪唑的白                          4.2 ? γ 干扰素 （IFN-γ）??
              油佐?，分?制?成油乳??活苗，各?免疫相同的                                取制?好的脾淋巴?胞?液加至 6 孔?胞培
              ?量 0.02 mL/ 只，免疫方式??部皮下注射，?察免                     ?板中，每孔 3 mL。37 ℃、5%CO2 培?箱?培? 5 d
              疫及保?效果。???物分?： A- 表示胚毒与含 2                        后移取?胞?液， 3000 r/min 离心 10 min，收集上清
              mg/mL左旋咪唑的白油佐?制?疫苗免疫?； B- 表                       液，4 ℃?存?用。
              示胚毒与含 5 mg/mL左旋咪唑的白油佐?制?疫苗                             采用?抗体一步?心法??免疫吸附??
              免疫?； C- 表示胚毒与含 10 mg/mL左旋咪唑的白油                   （ELISA） ?? IFN-γ，具体操作按? γ 干扰素
              佐?制?疫苗免疫?； D- 表示胚毒与不含左旋咪唑                        （IFN-γ）ELISA ????盒使用?明??行。向?

              的白油佐?制?疫苗免疫?； NC- 空白?照?。                          先包被 γ 干扰素 （IFN-γ）抗体的包被微孔中依次
                  每? 10 只 SPF ?，同?留 5 只不免疫作??                   加入?品、 ?准品、 HRP ??的??抗体，???育
              照?。免疫前采血， HI 抗体??均??性。分?在免                        并?底洗?后用底物 TMB ?色。?色的深?和?品
              疫后第 7 d、14 d、21 d 翅下??采血，分离血清，用                   中的 γ 干扰素（IFN-γ）呈正相?。用???在
              HI 方法?定血清抗体效价。                                    450 nm 波?下?定吸光度，?算?品?度。
              4.1 免疫?淋巴?胞增殖??            [3]                         IFN-γ ??操作步?：??室?平衡 20 min
                  ??期?每周每??机剖? 2 只?，取脾做淋                        后的?箔袋中取出所需板?，剩余板?用自封袋密
              巴?胞增殖??，以特异性全病毒蛋白刺激脾淋巴                            封放回 4 ℃；??置?准品孔、?本孔、空白孔。?
              ?胞，?察淋巴?胞增殖情?。淋巴?胞增殖??                            准品孔各加?度? 0 pg/mL、5 pg/mL、10 pg/mL、20
              ?照淋巴?胞增殖?? CCK-8 ??盒?明??行。                        pg/mL、40 pg/mL、80 pg/mL 的?准品 50 μL；?本孔
              ?脾淋巴?胞的制?：取 SPF ???注射空气?死                         先加待??本 10 μL，再加?本稀?液 40 μL（?

              后，放入 70%酒精中浸泡 5 min；之后?菌手??                       品最?稀?度? 5 倍）；空白孔不加；?除空白孔
              腹，取出脾?，放于加有不完全 RPMI-1640 培?基                      外，?准品孔和?本孔中每孔加入辣根?氧化物?


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